IL-10免疫组化IHC

时间:2024年01月21日 来源:

免疫荧光的制作:样品准备(贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等):对于贴壁细胞:先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理,然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中,用无菌PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片,操作小心,防止细胞脱片。对于悬浮细胞:有2种方法,①先在悬浮液中进行固定步骤,然后把细胞滴加在载玻片上,干燥后细胞会紧贴在载玻片上。②先在悬浮液中进行固定和染色步骤,离心洗脱,然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。对于冷冻切片:切片放置在载玻片上后,可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片:免疫荧光中石蜡切片较少,要先进行脱蜡和抗原修复处理。免疫荧光技术可以用于研究肉瘤的发生和发展过程。IL-10免疫组化IHC

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荧光效率:荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光,总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率,与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率=发射荧光的光量分子数(荧光强度)/吸收光的光量子数(激发光强度)。发射荧光的光量子数亦即荧光强度,除受激发光强度影响外,也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱(荧光光谱),即在某一特定波长处有较大吸收峰和较大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的较大吸收峰波长,且测定光波量接近于较大发射光波峰时,得到的荧光强度也较大。IL-10免疫组化IHC荧光抗体技术可用于检测和定位各种抗原,也可以用于检测和定位抗体。

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注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行.DAPI复染核:爬片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。封片:爬片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。镜检拍照:切片于荧光显微镜下观察并采集图像。(DAPI紫外激发波长330-380nm,发射波长420nm,发蓝光;FITC激发波长465-495nm,发射波长515-555nm,发绿光;CY3激发波长510-560,发射波长590nm,发红光)。两种抗体同时孵育:由于FIT容易萃灭,因此在孵育抗体时后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。

zo-1的免疫荧光,步骤如下:1.细胞在盖片上生长融合到95%-100%时,从孵箱中取出。2.用预温的1×PBS洗3次,每次10分钟。3.4%的甲醛室温固定20-30分钟。4.1×PBS洗3次,每次10分钟。5.0.2%TritonX-100透化2-5分钟。6.1×PBS洗3次,每次10分钟。7.5%BSA室温封闭30分钟。8.加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里,4度过夜。9.1×PBS洗3次,每次10分钟。10.加二抗(用1%BSA稀释)30分钟,闭光。11.1×PBS洗3次,每次10分钟。12.95%甘油封片。注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀释。免疫荧光技术可以用于研究细胞内分子的相互作用。

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细胞免疫荧光:细胞种板与细胞爬片制备:1) 细胞密度在90%-95%左右,用预热胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中,充分吹打,使之成单细胞悬液,计数。2)取细胞培养12孔板,在每个孔放爬片的位置根据爬片的大小,先在每个孔里准备放爬片的位置滴几滴培养基,然后将爬片置于液滴上,压紧,使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起,防止加细胞悬液时爬片漂起,造成双层细胞贴片。根据自己的需要选择合适的细胞密度种入12孔板培养板内。3)24h或者48h后,根据细胞生长速度快慢,观察判断细胞密度,约90%时进行细胞免疫荧光。免疫荧光技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域具有普遍应用。IL-10免疫组化IHC

免疫荧光技术可以用于研究药物的靶点和作用机制。IL-10免疫组化IHC

细胞免疫荧光简单实验步骤如下:1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小时。2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟。3. PBS洗净:3min×3。4. 1%Triton:25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗净:2×5 min。6. 羊血清封闭:37度,20分钟。7. 一抗,4度过夜,一般要大于18小时或者37度,1-2小时。8. 4度PBS洗净,3 min×5次。9. 二抗37度小于一小时。10. 37度 PBS洗净,3×5 min。11. 凉干封片(封闭液PH8.5);不管采用何种方法,在使用PBS缓冲液漂洗时,都要漂洗干净并且要测下pH值,可以使用PBS多清洗几次,也可以延长PBS清洗时间,如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时。IL-10免疫组化IHC

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