MAP2免疫抗体
细胞免疫荧光实验注意事项:1、建议细胞直接种孔板,采用倒置荧光显微镜拍照,这样可以避免然后挑片时造成划片或细胞片破损以及然后封片可能造成滑片等结果;2、若实验室只有正置荧光显微镜,则需要将细胞植于细胞爬片。建议直接购买处理过的细胞爬片;若只有普通细胞爬片,可以先将爬片于浓酸(浓酸腐蚀性强,注意操作)或 75% 乙醇浸泡过夜,若用酸浸泡过夜,第二天先用自来水小心冲洗掉爬片残留的酸液,若用 75% 乙醇浸泡,则不需要此步骤。然后,用洗洁精搓洗爬片,然后用去离子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干,再将爬片置于超净台造紫外消毒后备用。免疫荧光技术可以用于研究肉瘤的发生和发展过程。MAP2免疫抗体
免疫荧光的制作:样品准备(贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等):对于贴壁细胞:先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理,然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中,用无菌PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片,操作小心,防止细胞脱片。对于悬浮细胞:有2种方法,①先在悬浮液中进行固定步骤,然后把细胞滴加在载玻片上,干燥后细胞会紧贴在载玻片上。②先在悬浮液中进行固定和染色步骤,离心洗脱,然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。对于冷冻切片:切片放置在载玻片上后,可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片:免疫荧光中石蜡切片较少,要先进行脱蜡和抗原修复处理。MAP2免疫抗体荧光抗体技术可用于检测和定位各种抗原,也可以用于检测和定位抗体。
细胞免疫荧光主要用于蛋白定位研究和细胞内信号转导,细胞免疫荧光技术是利用免疫技术和荧光标记技术相结合,原理就是利用抗原-抗体反应之后,采用荧光标记,标记完成后,显微镜下观察细胞内某种抗原成分的多少,从而做出一个定位研究,也可以为细胞内信号传导提供一个明确的指导,细胞免疫荧光具有敏感性强、特异性高、速度快的特点,是目前比较常用的组织学技术,也是比较精确的。免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合,其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗,荧光显微镜下即可观察到荧光。
细胞免疫荧光实验注意事项:非特异性染色:是否灭活内源性过氧化物酶;孵育过程中干片;抗原热修复过度。染色过深:一抗浓度过高;染色试浓度过高或孵育时间过长;染色剂浓度过高或孵育时间过长。通常实验室先固定细胞再进行通透,但若检测抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,这样可以通过通透去除一些水溶性蛋白,进而可降低免疫荧光背景和非特异性信号;建议设阴性对照组,消除由于抗体非特异性结合而产生的背景染色;选择醛类固定液时,保持其新鲜度,较好现配现用,使用不新鲜的醛类固定液自发荧光背景会升高。免疫荧光技术可以用于研究遗传疾病和基因表达调控。
免疫荧光固定(防止离体组织自溶抗原扩散),固定液包括:有机溶剂(甲醇、乙醇等);交联剂(4%PFA、10%中性福尔马林),固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性,不过,目前甲醛用的还是较多的,但针对磷酸化的抗体,不适合用甲醛,会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中,故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇,同时应注意甲醛会挥发,在4-8°C不宜储存太久。固定时间:取决于组合块的大小和类型,对于大多数组织,18-24h较为理想,细胞固定时间较短,一般2%的甲醛室温固定20min即可。以细胞样品为例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。免疫荧光技术可以用于研究内脏移植和免疫抑制。NLRP3免疫荧光染色
免疫荧光技术可以用于研究细胞内分子的相互作用。MAP2免疫抗体
免疫荧光的原理和类型:免疫荧光利用荧光分子或荧光团在一定波长(分子的吸收光谱)下吸收光子的特性,经过短暂的间隔(发射光谱)后以较高的波长发射光子,并伴随能量损失。发射的荧光可通过显微镜观察到。荧光团可以通过可见光或紫外光激发。具有高光稳定性和荧光量子产率的荧光染料可在市场上购买,其激发较大值跨越从400到>700nm的波长范围。它们不会损伤活细胞,可安全用于生物制剂。在进行免疫荧光检测时,首先对细胞或组织进行固定和透化处理。进行免疫染色时,荧光团与目标抗原的抗体结合,然后使用成像显微镜观察荧光信号。根据使用的抗体和所需的信号扩增,免疫荧光可分为直接和间接两种类型。MAP2免疫抗体
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