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聚合酶链反应:嵌套聚合酶链反应:通过减少DNA非特异性扩增的背景,提高DNA扩增的特异性。两组引物用于两个连续的PCR。在个反应中,一对引物用于产生DNA产物,除了预期的靶之外,该产物可能仍然由非特异性扩增的DN段组成。然后用一组引物将产物用于第二次聚合酶链反应,所述引物的结合位点完全或部分不同于次反应中使用的每个引物,并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特异性扩增长DN段方面通常比传统PCR更成功,但它需要更详细的目标序列知识。重叠延伸聚合酶链反应或者通过重叠延伸拼接(SOEing):一种用于将两个或多个含有互补序列的DN段拼接在一起的基因工程技术。它用于连接含有基因、调节序列或突变的DN段;这项技术可以创造特定的长DNA构建体。它还可以将缺失、插入或点突变引入DNA序列。聚合酶链反应是一种非常强大和实用的研究工具。苏州实时荧光PCR供应商
聚合酶链式反应的试验污染:实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。污染的监测:一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。重复性试验。选择不同区域的引物进行PCR扩增。苏州实时荧光PCR供应商PCR反应的特异性决定因素为:引物与模板DNA特异正确的结合。
聚合酶链式反应:模板的制备,PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、菌类等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、氯仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是很好也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。检测:PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是很常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。序列间特异性聚合酶链反应是一种用于DNA指纹识别的聚合酶链反应方法。
聚合酶链式反应是一种体外迅速扩增DN段的技术,它能以极少量的DNA为模版,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时由于两条链之间的氢键被破坏也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复形成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不但操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。聚合酶链式反应中要确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。苏州实时荧光PCR供应商
多重连接依赖探针扩增允许用单个引物对扩增多个靶标,从而避免多重PCR的分辨率限制。苏州实时荧光PCR供应商
聚合酶链式反应的常见问题:PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些很好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性:不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有模板核酸的制备,引物的质量与特异性,酶的质量及溴乙锭的使用, PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板:模板中含有杂蛋白质,模板中含有Taq酶抑制剂,模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。苏州实时荧光PCR供应商
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