上海分子生物学荧光PCR原理及步骤
Real-time PCR:Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量较准确,重现性较好的定量方法,已得到全世界的公认,普遍用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。实时荧光定量PCR的定量方法,在Real-time PCR中,模板定量有两种策略,相对定量和定量。Real-time PCR反应的一个主要限制是,为了产生其选择性扩增的引物,需要目标序列的先前信息。上海分子生物学荧光PCR原理及步骤
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DN段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的很大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。到2013年,PCR已发展到第三代技术。连云港血液Real-time PCR方案嵌套式PCR在特异性扩增长DN段方面通常比传统PCR更成功,但它需要更详细的目标序列知识。
Real-timePCR的反应条件:dNTP浓度过高会加快反应速度,但同时还可以增加碱基的错误掺入率。引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。TaqDNA聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增,低则合成产物量减少。TaqDNA聚合酶无校正功能,掺入错误率达2*E-4个核苷酸,一个30个循环的扩增反应0.1%-0.25%总错误率。在90~95度下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95度30~60s。时间过长使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破坏增多。DNA很快冷却到40~60度使引物和模板结合。引物长度在15~25时退火温度。
聚合酶链式反应的试验污染:阳性对照,在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定。Real-time PCR技术即实时萤光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差。
引物的设计注意事项:1,引物设计要跨内含子,不能在一个外显子上(我们的实验是以cDNA为模板来扩增的,如果有DNA污染的话,因为DNA上含有分子量很大的内含子,不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用)。2,引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度,方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大,就得分开做,浪费模板,浪费管家基因,所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致,这样就不用每次查退火温度,且对整个实验有利。PCR的另一个限制是,即使是很少量的污染DNA也可以被扩增,导致误导或模糊的结果。上海分子生物学荧光PCR原理及步骤
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些很好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失。上海分子生物学荧光PCR原理及步骤
Real-time PCR探针法适用于:1、具有高适应性和可靠性,实验结果稳定重複性好,特异性更高。2、适用于扩增序列专一的体系的检测。3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。4、靶基因的特异序列较短,无论怎样较佳化引物设计条件都不能解决。5、存在与靶基因同源的序列,在PCR中容易出现非特异性扩增,对特异性要求较高的定量。6、普遍用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物製品的鉴定。Real-time PCR探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的萤光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团。探针完整时,报告基团发射的萤光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告萤光基团和淬灭萤光基团分离,从而萤光监测系统可接收到萤光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个萤光分子形成,实现了萤光信号的累积与PCR产物形成完全同步。上海分子生物学荧光PCR原理及步骤
上海司鼎生物科技有限公司主要经营范围是医药健康,拥有一支专业技术团队和良好的市场口碑。司鼎生物致力于为客户提供良好的免疫印迹(WB)技术服务,荧光定量PCR技术服务,膜片钳电生理技术服务,在体光纤成像记录技术服务,一切以用户需求为中心,深受广大客户的欢迎。公司秉持诚信为本的经营理念,在医药健康深耕多年,以技术为先导,以自主产品为重点,发挥人才优势,打造医药健康良好品牌。司鼎生物立足于全国市场,依托强大的研发实力,融合前沿的技术理念,及时响应客户的需求。
上一篇: 宁波微量数字PCR服务
下一篇: 厦门医学膜片钳电生理技术应用