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三、细胞实验D-荧光素钾盐体外生物发光试验：D-荧光素钾盐，无菌纯水，完全培养基（自行配制）1、贴壁细胞：将细胞接种于培养板中孵育数小时或过夜，使细胞贴壁。悬浮细胞：可以将细胞接种于培养板后直接进行后续操作，无需孵育。如果倍增时间相对较短，则应考虑倍增时间进行细胞计数。2、将15mg荧光素钾盐溶解于1ml无菌水中，制备成100X荧光素储备液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素钾盐完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。3、用预热好的细胞培养基1∶100稀释100X荧光素储备液（15mg/ml），配制成荧光素工作液（终浓度150μg/ml），即配即用。4、去除培养板中的培养基。5、在成像前，将适量荧光素工作液加入细胞中，然后进行图像分析。注意：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。孵育时间取决于特定的细胞类型。一般来说孵育10分钟就足够了，根据需要进行测试和调整。6、每隔10分钟，**多40分钟，使用VILBERFUSIONFX成像系统检查体外生物发光，确定动力学曲线并找出细胞的峰值成像时间点DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常见的细胞膜染料，它们是一族亲脂性的荧光染料，用于细胞的形态学和结构研究。宁夏荧光染料DIO

Cy7DiC18（DiR）是一个亲脂性、近红外荧光花青染料。这个染料常用于标记细胞质膜。Cy7DiC18（DiR）的两个18-碳链插入到细胞膜，从而进行特定的、稳定的细胞染色，几乎不会发生细胞间的染料转移。Cy7DiC18（DiR）（近红外荧光）和其他细胞膜荧光染料如DiI（橙色荧光），DiO（绿色荧光），DiD（红色荧光）配合使用，为多色成像和流式细胞分析提供了有效的工具。Cy7DiC18（DiR）染色后可进行多聚甲醛（不可使用甲醇等其他试剂）的固定，但不建议在染色后进行透化的过程。此外，在固定透化（室温下用0.1%TritonX-100透化）后，也可以很好地进行质膜染色。

1、Cy7DiC18（DiR）染色固定的细胞或组织样品时，通常使用配制在PBS中的4%多聚甲醛进行固定，使用其它不适当的固定液会导致荧光背景较高。

2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 合肥荧光染料红色吲哚菁绿在生物识别和药物输送方面也有广泛的应用。

常用抗体标记荧光染料的特性及其应用

1、FITC:激发波长488nm，比较大发射波长525nm。1)其标记的抗体适用于所有配备488nm氟离子激光器的流式细胞仪;2)在流式细胞仪的FL1通道检测;3)可用于荧光显微镜技术4)荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。2、AlexaFluor488:激发波长488nm，比较大发射波长519nm。1)其标记的抗体适用于所有配备488nm氟离子激光器的流式细胞仪:2)在流式细胞仪的FL1通道检测;3)具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术;4)在较宽的PH值范围内保持稳定(PH4~10)。5)南京星叶生物科技有限公司SuperFluor系列（效果同AlexaFluor系列）质优价廉，欢迎咨询。3、Cy3:激发波长488nm，比较大发射波长570nm。1)其标记的抗体适用于所有配备488nm氟离子激光器的流式细胞仪;2)在流式细胞仪的FL2通道检测:3)适用于荧光显微镜技术;4)为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于PE。

使用萤火虫荧光素酶（Fluc）作为报告基因和 D-荧光素作为底物的生物发光成像（BLI）是目前应用*****的技术。将总信号强度相对于 D-荧光素注射后的时间进行绘制，以生成时间-强度曲线。除了峰值信号外，还确定注射 D-荧光素后固定时间点（5、10、15 和 20 分钟）的信号作为峰值信号的替代。给定时间-强度曲线中的信号针对曲线中的峰值信号进行归一化，以表示 D-荧光素注射后时间变化的模式[3]。每克体重注射 10 μL D-荧光素（腹膜内或静脉注射）储备液：对于 20 g 小鼠，标准 150 mg/kg 注射通常约为 200 μL。在室温下解冻 D-荧光素（钾盐或钠盐）并溶解在 dPBS（不含钙或镁）中，**终浓度为 15 mg/mL。通过吸取 5-10 mL 无菌水来预湿 0.22 μm 过滤器。Super Fluor 680（效果同Alexa Fluor 680）琥珀酰亚胺酯荧光染料。

Cy3 (Cyanine 3) 是一种发橘黄色荧光的花青素荧光染料。Cy3染料的激发峰和发射峰分别在550 nm和570 nm左右，它的荧光肉眼观察很明亮，并且对pH不敏感，在共聚焦显微镜中可以用532nm（肩峰）或者556nm（顶峰）的激光束激发，在普通荧光显微镜中可以用 TRITC (tetramethylrhodamine) 的滤片观察，所以在绝大部分荧光仪器上都可以使用。Cy3也是Dil等细胞电位追踪剂的母核，所以它是在生物技术中非常有用的荧光染料。在荧光成像时，Cy3的背景荧光一般认为比TAMRA等TRITC系列的染料低。 Cy3可以用来标记蛋白，抗体，多肽等，它常见的使用是标记核酸分子（DNA和RNA）。基于荧光图谱的相似性，Cy3可以被TAMRA，TRITC, BODIPY TMR等染料替代，在需要更明亮，更稳定的替代物时，可以考虑使用AF547或者AF555等。非磺化花青类染料- 该组中的一些染料包括 cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7 和 cy7.5。合肥荧光染料红色

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS 染色的细胞可以分别用经典的FL1，FL2，FL3和FL4流式细胞仪检测。宁夏荧光染料DIO

蛋白荧光标记技术是目前**为常见的蛋白体外标记技术，利用级联放大反应原理，将极度敏感性且易于检测的荧光素通过某个基团吸附或共价结合后，标记到特异性抗原或抗体分子上，应用荧光显微镜观察荧光标记物因增强放大效应而产生颜色、光谱等变化，以分析示踪相应抗体或抗原性质与含量的方法。该技术在具有高度精确性的荧光显微镜下，借助高度灵敏性的荧光检测，在各种生物过程中对目的蛋白进行可视化，从而通过抗原抗体高度特异性免疫定量表达或在细胞研究中定位。蛋白荧光标记已成为研究蛋白质互作、酶活性、***示踪以及细胞分选重要工具。蛋白标记常用荧光染料随着蛋白荧光标记技术不断发展，各类荧光素广泛应用于生物实验中，目前常用标记蛋白/抗体的荧光素主要有BODIPY类、香豆素类、罗丹明类、近红外类、NBD胺类以及菁染料等。南京星叶生物科技有限公司提供多种性价比高的各类活化荧光素，其荧光染料覆盖波长范围从350nm到790nm，例如Cy系列、SuperFluor系列（效果同AlexaFluor系列）等，用于标记抗体、多肽以及蛋白功能基团，继而生成分子探针，通过荧光成像进行相应检测。宁夏荧光染料DIO