福建二代测序运用
二代测序的建库步骤⑥
六、文库质量检测
定量检测:使用荧光定量PCR(qPCR)或其他核酸定量方法(如Qubit)来确定文库的浓度。Qubit是一种基于荧光染料与核酸特异性结合的定量方法,它可以准确地测量DNA或RNA的浓度,并且对不同大小的核酸片段有较好的定量准确性。通过定量检测,可以了解文库的产量,为后续的测序上样量提供参考。
片段大小检测:利用琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪(如Agilent2100Bioanalyzer)来检测文库片段大小。琼脂糖凝胶电泳是一种传统的方法,通过将文库样品在琼脂糖凝胶中进行电泳,根据DNA片段在电场中的迁移速度来判断片段大小。生物分析仪则可以提供更精确的片段大小分布和浓度信息,它是基于微流体芯片技术,能够快速、准确地分析文库质量。 二代测序是为了改进一代测序通量过低的问题而出现的。福建二代测序运用
一代、二代、三代测序的技术原理和技术特点分别是什么?
技术原理:
一代—双脱氧终止法
二代—桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像
三代—PacBio SMRT测序技术
技术特点:
一代—只能检测序列一致的PCR产物;读长可以较长,比如Sanger可以达到几百bp;通量低,一次只能检测少量的序列;成本低;
二代—可以并行测序;需要放大信号才能检测;通量大,可以产生上G的reads;读长较短,一-般是固定的,比如50、100、150、250等;成本较高
三代:可以并行测序;不需要放大信号,对单个分子进行测序;通量大,比如SequelII平台,一张芯片可以有800万个ZMW;读长较长;测序精确度较差;成本高; 长宁区二代测序提供二代测序的优势是高通量。
④二代测序一般多久出结果?
4、数据分析的复杂程度
数据分析是二代测序的重要环节。简单的分析,如检测已知的单核苷酸多态性(SNP),可以通过与参考基因组比对后利用一些成熟的软件快速完成。但如果是进行复杂的分析,如寻找新的基因融合事件、复杂结构变异的检测或者进行从头组装(denovoassembly),则需要更复杂的算法和更多的计算资源,花费的时间可能从数天到数周。例如,对于常规的SNP检测和注释,数据分析可能在1-3天内完成;而对于**样本中复杂的基因融合分析,可能需要3-7天甚至更长时间来确保结果的准确性。
二代测序——质量控制类问题
如何评估二代测序数据的质量:主要通过一些质量指标来评估,如Q值(质量值)分布,用于衡量每个碱基的测序质量;碱基含量分布,检查四种碱基的比例是否正常;GC含量分布,看是否与预期的基因组GC含量相符;序列重复度,评估数据中重复序列的比例;比对率,即测序数据与参考基因组比对上的比例等。影响二代测序质量的因素有哪些:样本质量是关键因素之一,如DNA的纯度、完整性和浓度等会影响文库构建和测序结果;文库构建过程中的操作不当,如片段化过度、接头连接效率低等;测序仪器的性能和运行状态,包括试剂的质量、测序芯片的质量、仪器的校准等;生物信息学分析过程中的参数设置和算法选择也会对**终的结果质量产生影响。 二代测序需要分析吗?
二代测序的建库步骤③
三、末端修复和加A尾(以DNA文库为例)
末端修复:经过片段化后的DNA末端可能是不平齐的,有5'-突出端或3'-突出端。末端修复反应可以利用T4DNA聚合酶、Klenow片段等酶,将这些末端补平,使其成为平末端。T4DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,在合适的反应缓冲液和dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)存在下,可以将突出的末端补平。
加A尾:在末端修复后的平末端DNA分子的3'-末端加上一个A碱基。这一步是为了后续连接带有T-突出端的接头做准备,一般使用Klenow片段(3'→5'外切酶活性缺失)在dATP存在下进行加A反应,这样可以使DNA片段能够高效地与带有T-突出端的测序接头连接。 二代测序的优势是高准确性。广东二代测序价格
二代测序通量大,可以产生上G的reads.福建二代测序运用
二代测序——转录组测序的背景和基本原理
1、背景:在基因表达过程中,DNA 转录为 RNA,转录后的 RNA 会经过一系列加工,包括剪接等过程形成成熟的 mRNA,然后进行翻译产生蛋白质。转录组测序可以让我们在全基因组范围内研究基因的表达情况,相比于传统的基因表达研究方法(如芯片技术),它具有更高的分辨率和更广的检测范围。
2、原理:首先从样本(如细胞、组织)中提取总 RNA,然后将 RNA 反转录为 cDNA(互补 DNA)。这些 cDNA 会构建测序文库,在文库中加入特定的接头序列,以便后续在测序平台上进行测序。测序过程中,测序仪会读取 cDN**段的碱基序列信息。通过生物信息学分析,将这些短序列(reads)比对到参考基因组或进行从头组装(如果没有参考基因组),从而确定转录本的序列和表达量。 福建二代测序运用
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