美国investigator双光子显微镜光子探测

微型化双光子荧光显微成像改变了在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式，可用于在动物觅食、哺乳、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，或者在学习前、学习中和学习后，长时程观察神经突触、神经元、神经网络、远程连接的脑区等多尺度、多层次动态变化。该成果在2016年底美国神经科学年会、2017年5月冷泉港亚洲脑科学专题会议上报告后，得到包括多位诺贝尔奖获得者在内的国内外神经科学家的高度赞誉。冷泉港亚洲脑科学专题会议、美国明显神经科学家加州大学洛杉矶分校的Alcino J Silva教授在评述中写道，“从任何一个标准来看，这款显微镜都了一项重大技术发明，必将改变我们在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式。它所开启的大门，甚至超越了神经元和树突成像。系统神经生物学正在进入一个新的时代，即通过对细胞群体中可辨识的细胞和亚细胞结构的复杂生物学事件进行成像观测，从而更加深刻地理解进化所造就的大脑环路实现复杂行为的重要工程学原理。毫无疑问，这项非凡的发明让我们向着这一目标迈进了一步。”双光子显微镜是结合了双光子技术和扫描共聚显微镜的一种新型荧光显微镜。美国investigator双光子显微镜光子探测

研究人员通过用不同激光波长并行化激光扫描（wavelengthmultiplexing），增加了相同时间内可以成像的体积，并同时保持较高的时间和空间分辨率。通过引入两种波长不同的钙信号荧光探针，研究人员将神经元群体的活动标记为两个不同颜色，并同时用两个不同波长的激光激发探针，实现了两个颜色的并行化数据记录。为了实现三维空间成像，研究人员还分别在两个激光光路上配置了快速变焦系统，分别为电可调节透镜（electricaltunablelens）和空间光调制器（spatiallightmodulator）。由此，可以同时以10赫兹的速度记录500微米500微米的10个平面，覆盖纵深达600微米，涵盖了从脑皮层第2层到第5层的结构，体积内记录到的神经元可以达到2000个以上。美国双光子显微镜厂家有哪些在深度组织中以较长时间对细胞成像，双光子显微镜是当前之选。

美国霍华德·休斯医学研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小组与来自中科院上海光机所强场激光物理国家重点实验室的王琛博士较近成功将一种新的自适应光学的方法和双光子显微镜结合，研制出一种新的自适应光学双光子荧光显微镜。通过校正小鼠大脑的像差，在视觉皮层的不同深度处均获得了提高数倍的成像分辨率和信号强度，明显改进了成像质量，使得原来在鼠脑中不可见或者模糊的细节变得清晰可见，她们成功将该方法应用于老鼠视觉皮层第五层（约500µm）的形貌结构成像和钙离子功能成像。这一新的自适应光学方法，使得在小鼠深层区域成像中获得近衍射极限的成像分辨率成为现实。这一成果发表在较新一期的《Nature Methods》。

从双光子的原理和特点我们就可以明显的得出双光子的优点：☆光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究；☆穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；☆高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；☆漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象；☆荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器（共焦），这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高；☆图像对比度高：由于荧光波长小于入射波长，因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，降低了散射的干扰；☆光子跃迁具有很强的选择激发性，所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；双光子显微镜能够进行光裂解、光转染和光损伤等光学操纵。

系统示意图如图1所示，红外激光束从蓝宝石激光器出射后，由一个光学参量振荡器（OPO）转化到可见光波段，产生的可见光脉冲宽度为200 fs, 重复频率80 MHz，波长在490-750nm范围内可调谐。光束通过透镜及平面镜中继到包含微透镜阵列盘和阵列盘的共聚焦扫描单元中，形成用于荧光激发的多焦点光束。多焦点光束通过一个硅油浸润的物镜成像到样品上，激发荧光信号。荧光信号由同一个物镜收集并传输到阵列圆盘，产生共焦效应，隔离来自焦平面外的杂散光。双光子显微镜将得到更大的发展与更广的应用。进口2PPLUS双光子显微镜商家

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单光子显微技术是成熟的荧光显微技术，但由于其使用的激发光波长较短，成像深度有限；能量较大,会造成对荧光物质的漂白,光毒性严重。激光共焦扫描显微镜由于共焦显微镜的孔径很小,实现样本三维成像要逐点扫描,成像速度慢,对样本损害大,很难用于长时间活细胞成像。而宽场显微镜能够很好地实现实时动态成像,光漂白小,因而较早应用于活细胞内的实时检测，但宽场显微镜由于离焦信号的干扰,难以实现多维成像。双光子荧光显微镜（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。双光子显微成像技术是近些年发展起来的结合了共聚焦激光扫描显微镜和双光子激发技术的一种新型非线性光学成像方法,采用长波激发，能对组织进行深层次成像。常用的比较好激发波长大多位于800-900nm，而水、血液和固有组织发色团对这个波段的光吸收率低，此外散射的激发光子不能激发样品，因此背景第，光损伤小，适用于在体检测。双光子荧光成像技术能准确定位细胞内置入的微电极位置，从而观察胞体、树突甚至单个树突棘的活性。研究者可完整的观察神经组织的分辨荧光图像,甚至可以分辨神经细胞单个树突棘中的钙分布。美国investigator双光子显微镜光子探测

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