klf8免疫抗体

时间:2023年07月03日 来源:

细胞的固定及免疫荧光:1)吸除培养基,一般先加入PBS浸洗细胞 3 次,每次 5 min。2)向孔内加入4%多聚甲醛1ml,进行细胞固定,室温固定20分钟。3)吸去多聚甲醛,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。4)向孔内加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20min,目的是使细胞通透。5) 除去Triton X-100,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。6)用10%的与二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封闭2小时(选择的封闭液与后面操作过程中抗体稀释液一致)。封闭后不需要用PBS清洗。7)吸去封闭液,向每孔滴加足够量适宜浓度的一抗(一次使用抗体可以根据抗体说明书推荐浓度,后续实验可以摸索抗体的适宜浓度),4℃湿盒内孵育过夜。免疫荧光技术可以用于研究代谢疾病和内分泌系统的功能。klf8免疫抗体

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免疫荧光-实验步骤:细胞爬片免疫荧光:在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;(圆盖片:13mm24孔;18mm12孔;20mm6孔)用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA(PBS配置),室温封闭30min5,吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量用PBS稀释好的一抗并放入湿盒,4℃孵育过夜。加荧光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中室温孵育50min。Histone H2A.X免疫组化IHC免疫荧光技术是将抗体与荧光素等示踪物质结合,通过抗原抗体反应进行定位。

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荧光效率:荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光,总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率,与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率=发射荧光的光量分子数(荧光强度)/吸收光的光量子数(激发光强度)。发射荧光的光量子数亦即荧光强度,除受激发光强度影响外,也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱(荧光光谱),即在某一特定波长处有较大吸收峰和较大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的较大吸收峰波长,且测定光波量接近于较大发射光波峰时,得到的荧光强度也较大。

免疫荧光的制作:样品准备(贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等):对于贴壁细胞:先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理,然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中,用无菌PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片,操作小心,防止细胞脱片。对于悬浮细胞:有2种方法,①先在悬浮液中进行固定步骤,然后把细胞滴加在载玻片上,干燥后细胞会紧贴在载玻片上。②先在悬浮液中进行固定和染色步骤,离心洗脱,然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。对于冷冻切片:切片放置在载玻片上后,可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片:免疫荧光中石蜡切片较少,要先进行脱蜡和抗原修复处理。在1941年,Coons初次成功地使用荧光素作为标记物质进行免疫荧光实验。

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免疫荧光的原理和类型:免疫荧光利用荧光分子或荧光团在一定波长(分子的吸收光谱)下吸收光子的特性,经过短暂的间隔(发射光谱)后以较高的波长发射光子,并伴随能量损失。发射的荧光可通过显微镜观察到。荧光团可以通过可见光或紫外光激发。具有高光稳定性和荧光量子产率的荧光染料可在市场上购买,其激发较大值跨越从400到>700nm的波长范围。它们不会损伤活细胞,可安全用于生物制剂。在进行免疫荧光检测时,首先对细胞或组织进行固定和透化处理。进行免疫染色时,荧光团与目标抗原的抗体结合,然后使用成像显微镜观察荧光信号。根据使用的抗体和所需的信号扩增,免疫荧光可分为直接和间接两种类型。免疫荧光技术是基于免疫学、生物化学和显微镜技术的重要方法之一。公司免疫荧光IF

免疫荧光技术可以用于研究细胞信号传导和信号通路。klf8免疫抗体

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