PD-L1免疫荧光分析
免疫荧光检测相对于酶检测的优势:定量荧光信号的能力(与使用基于酶的方法进行的定性测定相反);复用能力(可以结合不同发射光谱的荧光染料来检测多种蛋白质);荧光染料的光稳定性。免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗体,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测组织或细胞内的相应抗原(或抗体)。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(黄绿色或橘红色),可以看见荧光所在的组织细胞,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。荧光抗体法和荧光抗原法都属于免疫荧光技术的范畴。PD-L1免疫荧光分析
免疫荧光实验步骤:1.样本准备:细胞或薄组织。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。2.固定:取适当的固定剂固定样本。一般用4%PFA固定4℃过夜。固定完毕后的样本可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。3.洗涤:PBS洗涤5min*3次。4.打孔:选择合适的通透剂处理样本,目的是使抗体更容易进入细胞与抗原结合。IL-10免疫组化IHC免疫荧光技术可以用于研究神经系统的功能和疾病。
免疫荧光实验的注意事项:对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10min到数小时,一般30min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37℃30min效果好的多。
免疫荧光技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是:非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同,还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比,荧光免疫法无放射性污染,并且大多操作简便,便于推广。国外生产的TDM用试剂盒,有相当一部分即属于此类,并且还有TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。由于一般荧光测定中的本底较高等问题,荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。新发展了几种特殊的荧光免疫测定,与酶免疫测定和放射免疫分析一样,在临床检验中应用。免疫荧光技术在免疫学研究中发挥重要作用,帮助揭示细胞和分子的功能和相互关系。
细胞免疫荧光步骤是什么呢?步骤:1. 细胞一定要贴在玻片上(较好可以放入24孔板),为后面照像打基础。细胞密度适中,大约60-75%满片即可,否则容易脱片。2. 取出细胞后用4%多聚甲醛固定15分钟,现用现配。(以下各步骤切毋使玻片干燥)3. PBS冲洗;4. 0.1%Triton作用20分钟;5. PBS冲洗;6. 10%正常血清封闭10分钟;7. 加入一抗,4度孵育过夜(找个小瓶盖将小玻片支起来,抗体就不容易溢出),还要记住“砸片”,就是抗体从较高处落到片子上,以分布均匀。抗体稀释度1:60,较常用!8. PBS冲洗4次,各5分钟;9加入荧光二抗,室温30分钟。抗体稀释度1:400,较常用!10. 90%甘油封片。也很关键阿,多封几次才有体会。12. 避光保存,或到显微镜下观察。免疫荧光技术可以用于研究病毒传播和免疫应答。AR免疫检测
使用已知荧光抗原标记物质来检查相应抗体的方法被称为荧光抗原技术。PD-L1免疫荧光分析
荧光物质,荧光色素:许多物质都可产生荧光现象,但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有:⑴异硫氰酸荧光素为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4,较大吸收光波长为490--495nm,较大发射光波长520--530nm,呈现明亮的黄绿色荧光,结构式如下:有两种同分异结构,其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好,在冷暗干燥处可保存多年,是应用较普遍的荧光素。其主要优点是:①人眼对黄绿色较为敏感,②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。⑵四乙基罗丹明为橘红色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性质稳定,可长期保存。结构式如下:较大吸收光波长为570nm,较大发射光波长为595~600nm,呈橘红色荧光。⑶四甲基异硫氰酸罗丹明结构式如下:较大吸引光波长为550nm,较大发射光波长为620nm,呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明,可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合,但荧光效率较低。PD-L1免疫荧光分析
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