C-FOS免疫荧光染色

细胞免疫荧光实验常见问题:1、信号弱或者无信号：细胞或组织样本保存时间过长；2）抗体浓度不合适，参照抗体说明书的稀释浓度，再根据样本表达量进行摸索；3）一抗孵育时间不合适，建议 4 ℃ 过夜孵育。2、高背景：封闭不充分；抗体浓度过高；抗体孵育时间过长或温度过高；清洗不充分；样本变干，染色过程确保样品始终浸没于液体环境中.3、非特异性染色较多：固定液残留，这里需要缩短固定时间并且在封闭液中加甘氨酸，并且抗原修复也可以帮助解决非特异性染色；二抗残留，二抗需要用带有吐温 20 的 PBS 溶解，只要荧光显微镜的强度还可以增大，那么就可以增加吐温洗脱掉非特异性染色。荧光抗体技术可用于检测和定位各种抗原，也可以用于检测和定位抗体。C-FOS免疫荧光染色

免疫荧光Coons等于1941年初次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。S100A4免疫抗体免疫荧光技术可以用于研究细胞内蛋白质的定位和表达水平。

免疫荧光间接法测抗体实验步骤：滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。重复操作3。取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。

免疫荧光-实验步骤：细胞爬片免疫荧光：在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圆盖片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室温封闭30min5,吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量用PBS稀释好的一抗并放入湿盒,4℃孵育过夜。加荧光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中室温孵育50min。荧光抗体技术具有高灵敏度和高特异性，可以实现精确的免疫检测。

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。在此基础上又分为两种方法：直接法和间接法。直接法：将标记的特异性荧光抗体直接加到抗原上，经过一定时间反应，即可结合并显色。间接法：先用抗原的抗体（一抗）与抗原反应结合，再用荧光标记的二抗（一抗的抗体）与抗原反应，形成抗体-抗原-抗体复合物。免疫荧光技术可以通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号，从而确定目标分子的存在和位置。C-FOS免疫荧光染色

使用荧光抗体方法是免疫荧光技术中常见的操作步骤。C-FOS免疫荧光染色

荧光素标记抗体的方法：方法及步骤：①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使然后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。C-FOS免疫荧光染色