多重免疫检测

荧光色素：四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC），其结构式如下所示，比较大吸收光波长为 550nm，比较大发射光波长为 620nm，呈现出橙红色荧光。和 FITC 的翠绿色荧光形成鲜明对比，能够配合用于双重标记或者对比染色。它的异硫氰基能够和蛋白质相结合，不过荧光效率比较低。免疫荧光技术也被称作荧光抗体技术，属于标记免疫技术中发展相对较早的一种。很早的时候就有一些学者尝试把抗体分子与某些示踪物质进行结合，借助抗原抗体反应来对组织或细胞内的抗原物质进行定位，而该技术就是在此基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术中，以荧光物质标记抗体来定位抗原物质的方法被称为荧光抗体技术。多重免疫检测

在胚胎神经系统发育过程中，神经元的分化、迁移和神经回路的形成是复杂而有序的过程。利用多色免疫荧光，我们可以用不同颜色标记神经元的不同发育阶段标志物。例如，用绿色荧光标记神经干细胞的标志物，红色荧光标记正在分化的神经元的标志物，蓝色荧光标记已经成熟的神经元的标志物。这样就能在胚胎脑组织切片上观察到神经干细胞是如何逐渐分化为成熟神经元，以及这些神经元如何迁移到特定位置形成神经回路的。同时，我们还可以用不同颜色标记神经发育过程中的信号分子和细胞外基质成分。比如，用黄色荧光标记神经营养因子，紫色荧光标记神经细胞迁移过程中依赖的细胞外基质蛋白。通过观察这些标记成分与神经元的相互关系，可以深入研究神经系统发育的调控机制，包括信号分子对神经元分化和迁移的诱导作用，以及细胞外基质对神经细胞定位的支持作用。CRT(Calreticulin)免疫荧光在1941年，Coons初次成功地使用荧光素作为标记物质进行免疫荧光实验。

细胞的固定及免疫荧光：1)吸除培养基，一般先加入PBS浸洗细胞 3 次，每次 5 min。2)向孔内加入4%多聚甲醛1ml，进行细胞固定，室温固定20分钟。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔内加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20min，目的是使细胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的与二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封闭2小时（选择的封闭液与后面操作过程中抗体稀释液一致）。封闭后不需要用PBS清洗。7)吸去封闭液，向每孔滴加足够量适宜浓度的一抗（一次使用抗体可以根据抗体说明书推荐浓度，后续实验可以摸索抗体的适宜浓度），4℃湿盒内孵育过夜。

免疫荧光在肿瘤免疫***中具有重要的价值，为评估***效果和探索***机制提供了有力工具。在免疫检查点抑制剂*****的研究中，免疫荧光可以标记肿瘤细胞表面的免疫检查点分子，如程序性死亡受体-1（PD-1）及其配体（PD-L1）。通过观察***前后这些分子在肿瘤细胞和免疫细胞上的表达变化，可以评估免疫检查点抑制剂的***效果。同时，免疫荧光还可以标记**微环境中的免疫细胞，如T细胞、NK细胞等，观察它们在***过程中的浸润情况和功能状态变化，为理解免疫检查点抑制剂的***机制提供依据。在**疫苗研发和评价方面，免疫荧光可用于标记**疫苗所针对的**抗原。通过观察**抗原在肿瘤细胞和免疫细胞中的表达和递呈情况，可以评估**疫苗的有效性。同时，免疫荧光还可以标记免疫细胞对**疫苗的应答情况，如T细胞的活化和增殖，为**疫苗的优化提供参考。免疫荧光技术可以用于研究肉瘤的发生和发展过程。

直接免疫荧光：单抗体（一抗）用于免疫染色和检测目标蛋白。荧光素结合的一抗直接与目标抗原结合，并使用成像显微镜观察。直接免疫荧光的优点：由于无需为两种抗体选择不同的物种反应性，从而降低了物种交叉反应性问题。与间接免疫荧光相比，时间缩短（操作步骤减少）。直接免疫荧光的缺点：不允许通过二抗进行信号放大；检测灵敏度降低；荧光素结合一抗的选择有限；与使用荧光二抗的检测相比，更昂贵。间接免疫荧光：使用两种抗体（一抗和二抗）进行免疫染色并检测目标蛋白。首先，用特异性一抗标记目标蛋白。然后，荧光素结合的二抗（与一抗具有不同的物种反应性）识别结合的抗原-抗体复合物并与一抗结合。由于一个以上的二抗可以与一抗结合，荧光信号被放大，提供了更高的检测灵敏度。免疫荧光技术可以用于研究细胞凋亡、细胞增殖和细胞分化等生物学过程。alpha 1 Fetoprotein免疫检测

免疫荧光技术在生物医学研究中具有普遍的应用前景。多重免疫检测

注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行.DAPI复染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光）。两种抗体同时孵育：由于FIT容易萃灭，因此在孵育抗体时后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。多重免疫检测