美国清醒动物多光子显微镜成像深度

因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80至100兆赫兹。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是比较高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦***，提高了荧光检测效率。利用多光子显微镜，进行组织内深层结构的无损成像。美国清醒动物多光子显微镜成像深度

Ca2+是一种重要的第二信使，在调节细胞生理反应中起着重要作用。发展和利用双光子荧光显微成像技术观测Ca2+荧光信号，可以从某些方面分析生物体或细胞的变化机制，具有重要意义。利用双光子荧光显微成像技术，我们可以观察到细胞内荧光探针标记的Ca2*的时间和空间荧光图像的变化，也可以观察到一定水平或部分细胞内(Ca2+)的荧光图像和变化。通过对单个细胞的研究发现，Ca2+的分布不仅在细胞的局部区域之间是不均匀的，而且在细胞内不同深度或层次的局部区域之间也存在不同程度的Ca2+梯度，称为空间Ca2+梯度。清醒动物多光子显微镜配置滔博生物多光子显微镜广应用于生命科学、生物医学和材料科学领域!

单光子激发荧光的过程，就是荧光分子吸收一个光子，从基态跃迁到激发态，跃迁以后，能量较大的激发态分子，通过内转换把部分能量转移给周围的分子，自己回到比较低电子激发态的比较低振动能级。处于比较低电子激发态的比较低振动能级的分子的平均寿命大约在10s左右。这时它不是通过内转换的方式来消耗能量，回到基态，而是通过发射出相应的光量子来释放能量，回到基态的各个不同的振动能级时，就发射荧光。因为在发射荧光以前已经有一部分能量被消耗，所以发射的荧光的能量要比吸收的能量小，也就是荧光的特征波长要比吸收的特征波长来的长。

快速光栅扫描有多种实现方式，使用振镜进行快速2D扫描，将振镜和可调电动透镜结合在一起进行快速3D扫描，但可调电动透镜由于机械惯性的限制在轴向无法快速进行焦点切换，影响成像速度，现可使用空间光调制器（SLM）代替。远程聚焦也是一种实现3D成像的手段，如图2所示。在LSU模块中，扫描振镜进行横向扫描，ASU模块包括物镜L1和反射镜M，通过调控M的位置实现轴向扫描。该技术不仅可以校正主物镜L2引入的光学像差，还可以进行快速的轴向扫描。想要获得更多神经元成像，可以通过调整显微镜的物镜设计来扩大FOV，但是具有大NA和大FOV的物镜通常重量较大，无法快速移动以进行快速轴向扫描，因此大型FOV系统依赖于远程聚焦、SLM和可调电动透镜。多光子显微镜，助力科研人员深入探索生命科学的奥秘。

世界多光子激光扫描显微镜产业主要布局在德国和日本，德国是以徕卡显微系统和蔡司为，而日本以尼康和奥林巴斯公司为，2020年，上述企业占据着世界多光子激光扫描显微镜市场64.44%的市场份额，其发展战略左右着多光子激光扫描显微镜市场的走向。目前世界市场对多光子激光扫描显微镜的需求在增长，中国市场这方面的需求增长更快，未来五年多光子激光扫描显微镜市场的发展在中国将具有很大的发展潜力。国内显微镜制造市场目前断层严重。目前我国显微镜行业发展缺乏技术沉淀，20年以上经营积累的企业十分稀缺，深度精密制造、光学重要部件设计及工艺严重制约产业升级。目前中国显微镜中如多光子显微镜、共聚焦扫描和电子显微镜等主要集中在徕卡显微系统、蔡司、尼康、奥林巴斯等国外企业。国内具备生产显微镜能力的企业屈指可数，若国内显微镜企业能打破技术壁垒，切入显微镜市场，企业的生产经营将腾跃至一个更高的格局。由于光的波长有限，光子显微镜的分辨率受到限制，无法观察到更小的结构和细胞器。美国清醒动物多光子显微镜实验操作

多光子显微镜可以更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。美国清醒动物多光子显微镜成像深度

多光子显微镜对成像深度的改善利用红光或红外光激发，光散射小（小粒子的散射与波长的四次方的成反比）。不需要***，能更多收集来自成像截面的散射光子。***不能区分由离焦区域或焦点区发射出的散射光子，多光子在深层成像信噪比好。单光子激发所用的紫外或可见光在光束到达焦平面之前易被样品吸收而衰减，不易对深层激发。多光子荧光成像的特点。深度成像∶与共聚焦相比能更好地对厚散射物质成像。信噪比∶多光子吸收采用的波长是单光子吸收的2倍以上，所以显微试样中的瑞利散射更小，荧光测定的信噪比更高。观察活细胞∶离子测量（i.e.Ca2+），GFP，发育生物学等—减少了光毒性和光漂白，能对细胞长时间观察。美国清醒动物多光子显微镜成像深度