静安区提供疾病动物模型建模

1、动物模型名称：二甲基苯蒽(DMBA)致乳腺*大鼠模型2、实验动物种属：SD大鼠3、实验动物性别：雌性4、实验动物年龄：6~8周龄5、实验动物体重：80~100g6、实验动物环境：SPF级 1、实验方法：二甲基苯并蒽(DMBA)诱导。大鼠按100mg/kg体重于臀部皮下一次性注射10mg/mL的DMBA溶液1次。正常饲养致24周。2、检测标准：模型组大鼠第5对乳房直径在各测定时间点与正常对照组比较有***性差异；大鼠注射致*剂后乳腺上皮组织逐渐发生有规律的变化，乳腺导管上皮细胞首先发生上皮增生、不典型增生，并逐渐加重，在第9周时可见同一大鼠的多个乳腺出现不同程度的导管上皮增生和不典型增生。第13周开始发现>3mm的乳腺*，至第24周时70%的大鼠发生乳腺*，并可见一只大鼠同时发生多个乳腺*，而同一大鼠的其他乳腺亦呈现出不同程度的上皮细胞增生和不典型增生，提示处于*发生的不同进展阶段。上海东寰为您提供完善的小鼠动物疾病模型。静安区提供疾病动物模型建模

    即为本发明构建的一种pirb基因敲入的小鼠动物模型。本发明所采用第二种技术方案的特点还在于，步骤1中得到grna1和grna2后分别与trancrrna在25℃孵育10min形成二级结构。步骤3中grna1、grna2的浓度均为2～10pmol/ul，cas9蛋白的注射浓度为30～100ng/μl。步骤4中southern杂交采用bamhi和avrii核酸内切酶切割f1代杂合子小鼠的dna。本发明的有益效果是：本发明提供了pirb基因敲入的小鼠动物模型及其构建方法，本发明的小鼠动物模型对于pirb基因功能的研究和在体验证提供了良好的基础。分离自pirb基因敲入小鼠的细胞还可以用于研究pirb发挥调节作用的下游机制。通过pirb敲入动物模型与不同类型cre小鼠的杂交，可以用于研究ad不同***或不同细胞类型pirb的调节作用。附图说明图1为本发明pirb基因敲入的小鼠插入pirb基因cds和loxp位点的打靶质粒载体的构建图；图2为本发明pirb基因敲入的小鼠模型的构建方法的流程图；图3为本发明f1代pirb敲入的小鼠的基因型pcr结果鉴定电泳图；图4为本发明f1代pirb敲入的小鼠验证pirb基因敲入效果的测序峰图；图5为本发明f1代pirb基因敲入的小鼠进行southern鉴定的方法示意图；图6为本发明f1代pirb基因敲入的小鼠进行southern鉴定的结果图。静安区提供疾病动物模型建模实验动物向小型化的发展趋势更有利于实验者的日常管理和实验操作。

1、自发性**动物模型:未经人为处理;自然发生;自发性**的总体评价--动物自发性**的病因往往是由动物的遗传特性决定的与人痒的病因有较大距离。各动物**生长速度差异较大很难在限定时间内获得大量生长均匀的荷瘤动物(tumor-bearinganimals)。因此，自发性**动物模型很少在抗**药物的常规筛选中广泛应用。2、诱发性**动物模型:在实验条件下:使用致*物(carcinogens);诱发动物发生**animalmodelofinducedtumor)指使用致*因素(carcinogens)在实验条件下诱发动物发生**的动物模型，它是进行实验**学研究的常用方法。常用于验证可疑致*因素的作用也越来越多地应用干**发生机理的研究及防治效果的观察上，在**病因学、遗传学、生物学等方面的研究中有重要地位。由于诱发因素和条件可人为控制，诱发率远高于自然发病率故在**实验研究中优于自发瘤。用于诱发实验性**的动物种类很多，它们因种族不同而对相同致*因素有不同的反应性。常用的动物以哺乳动物为主，其中啮齿类动物的使用**多，应用**广，包括各种大鼠、小鼠、际鼠等。。

目前鉴定出15个外显子，外显子1起始密码为atg，外显子15的终止密码子是tga(转录本：)。pirb蛋白属于i型跨膜糖蛋白，包含由六个免疫球蛋白样结构域(domain，d)组成(d1-d6)的胞外段，一个疏水的跨膜段，三个免疫受体酪氨酸依赖的抑制序列(immunoreceptortyrosinebasedinhibitorymotifs，itims)和一个itims样序列组成的胞内段。理论上讲，pirb的分子量约为92kd，但是western-blot分析中，pirb经常位于105kd处，因为pirb是糖蛋白。以往研究发现，pirb在免疫系统和中枢调节中均发挥重要作用。在免疫系统中，pirb在许多造血细胞都有表达，包括b细胞、肥大细胞、巨噬细胞、粒细胞和树突细胞，但是在胸腺细胞、成熟的t细胞和自然杀伤细胞不表达。小鼠疾病建模请找上海东寰。

    pirb在轴突生长锥表达，位于富含肌动蛋白的前缘和synapsin免疫阳性的囊泡中，在神经元突起的表达呈点状分布。文献表明，pirb表达随年龄增加，特别是在老龄认知损伤的小鼠海马中，pirb能够抑制轴突再生和突触可塑性。研究表明小鼠aβ寡聚体对海马长时程增强的破坏作用需要pirb的参与，在ad转基因模型中，pirb不仅参与成年小鼠记忆缺失，而且介导幼年小鼠视皮层突触可塑性的丢失。这些研究提示我们，pirb参与突触可塑性，抑制pirb可能对ad起到***效应。但是在cns，pirb的功能和下游抑制性信号通路仍然未被阐明，因此迫切需要pirb的细胞和动物模型。目前对于pirb基因功能的研究，多采用可溶性的pirb的胞外段(pirbextracellularpeptide，pep)和抑制剂，或者采用慢病毒转染。前者受到是否能够透过血脑屏障和抑制剂效率的影响，后者慢病毒转染在原代细胞和在体的转染效率比较低，使研究pirb的功能受到极大的限制。为解决这些问题，我们通过crispr/cas9技术建立了pirb基因敲入小鼠，将pirb基因敲入c57bl/6j的rosa26位点，为研究pirb在免疫系统或者神经系统的作用和机制提供了很好的工具。技术实现要素：本发明的目的在于提供pirb基因敲入的小鼠动物模型。明确研究疾病的独特资源确定小鼠疾病模型的初步选择。静安区提供疾病动物模型建模

上海东寰提供动物模型构建过程中的原始实验记录及数据图片。静安区提供疾病动物模型建模

    步骤i.将步骤h的吸附柱放入收集管，12000rpm离心2min。步骤j.吸附柱放到一个新的，在吸附柱膜**加入50～200μl灭菌水或者洗脱液，停留5min。(将无菌水或者洗脱液加热到65℃能够增加洗脱的得率)。步骤i.基因组dna定量，洗脱的基因组dna可以通过电泳鉴定。方法2：一种低成本基因组dna的粗提方法：步骤a.每只小鼠剪下一段尾巴(2-5mm)，放入离心管中，加入100μl尾部消化缓冲液，注意不要剪尾太长；步骤b.将离心管及其内容物于56℃孵育过夜；步骤c.过夜后将离心管于98℃孵育13min，使蛋白酶k失活；步骤d.在微型离心机以**大转速旋转15min，上清直接用于pcr体系(每50μlpcr体系加入上清2μl)。尾消化缓冲液成分：50mmkcl10mmtris-hcl()％tritonx-100(b)长链pcr反应：长链引物：pcrprimers1(℃):扩增片段：5’armforwardprimer(f1):5’-tacgccacagggagtccaagaatg-3’5’kireverseprimer(r1):5’-gatggggagagtgaagcagaacg-3’pcrprimers2(℃):扩增片段：3’kiforwardprimer(f2):5’-ctgctgtccattccttattccatag-3’3’armreverseprimer(r2):5’-ctggaaatcaggctgcaaatctc-3’pirb基因敲除型有上述两条扩增片段，野生型等位基因没有扩增产物。静安区提供疾病动物模型建模

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