江苏互作蛋白检测CoIP-MS检测

免疫共沉淀实验步骤主要包括以下五个部分：样品处理：将细胞或组织样品进行裂解，得到待检测的蛋白质混合物，并加入蛋白酶抑制剂以避免目标蛋白被降解。抗体处理：将专一的抗体连接到亲和树脂上，如蛋白A的亲和树脂或蛋白G的亲和树脂，或将蛋白与其特异性抗体结合，新形成的复合物与封闭剂缓慢摇摆在二氧化硅珠上，使碘酸钙交联后节制反应。免疫共沉淀：将有抗体树脂的样品与吸附抗体树脂形成免疫复合物。洗涤：采用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，以去除非特异性的蛋白质和杂质，同时尽量避免对复合物的影响。洗涤缓冲液选择对样品不会引起较大影响的缓冲液和洗涤剂。蛋白鉴定：将沉淀的复合物通过SDS-PAGE分离出来，并进行Western blotting检测目标蛋白及其配偶蛋白。另一方面，也可以直接使用质谱分析检测。蛋白质与蛋白质分子互作实验方法介绍。江苏互作蛋白检测CoIP-MS检测

免疫共沉淀也存在一些局限性。例如，它可能无法检测到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用。此外，两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用。此外，实验前需要预测目的蛋白以选择相应的抗体，因此，如果预测不正确，实验可能无法得到结果，这使得这种方法具有一定的冒险性。总的来说，免疫共沉淀是一种强大的技术，它能够为我们提供关于蛋白质相互作用的宝贵信息。然而，为了得到准确和可靠的结果，我们需要谨慎地解释和分析实验数据，并考虑到这种方法的局限性。上海免疫沉淀检测CoIP Western Blot检测免疫共沉淀实验：样品处理、抗体处理、共沉淀、洗涤及鉴定，一气呵成！

Co-IP（免疫共沉淀）实验的内源检测是验证蛋白质相互作用的关键步骤。内源检测的目的是确认在细胞内自然状态下，目标蛋白与预测相互作用的蛋白是否真实存在相互作用。内源检测的成功与否直接关系到Co-IP实验结果的可靠性。如果内源检测结果阳性，说明目标蛋白与预测相互作用的蛋白在细胞内真实存在相互作用，这为后续的蛋白质功能研究和药物开发提供了重要的线索和依据。需要注意的是，内源检测可能受到多种因素的影响，如抗体特异性、细胞裂解条件、洗涤条件等。因此，在进行Co-IP实验时，需要严格控制实验条件，选择特异性强的抗体，并进行充分的洗涤步骤，以确保内源检测结果的准确性和可靠性。

COIP技术优点如下：

相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；

蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；

可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

然而该技术也存在缺点，具体如下：

可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；

两蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；

须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择后面检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 免疫共沉淀存在检测局限、相互作用不确定、灵敏度不足等缺陷。

CoIP实验细胞的收集及裂解方法：

收集2E7个细胞样品，加入PBS洗涤细胞，离心后弃上清收集细胞沉淀。

准备500μl预冷的CellLysisBuffer,分别加入5μlProteaseInhibitor、5μlPMSF，混匀后加进细胞沉淀中吹打均匀，冰上孵育30min，期间涡旋混匀几次。

4℃,12000rpm离心10min，取上清，进行蛋白浓度测定及后续实验。

CoIP实验免疫复合物的制备：

在离心管中，将每个样品的细胞裂解液与2-10μg免疫沉淀抗体结合。每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为500-1000μg，由PierceBCAProteinAssay蛋白浓度检测试剂盒测定。

用免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液将抗体/裂解液稀释至500μL。

在室温下孵育1-2h，或4℃过夜，以形成免疫复合物。 Co-IP内源检测需注意抗体选择、实验条件、样本处理及验证，确保结果准确可靠！蛋白蛋白互作检测CoIP Western Blot检测

Co-IP实验要点：温和裂解、验证抗体、充分结合、沉降分离、洗脱纯化，确保结果准确可靠！江苏互作蛋白检测CoIP-MS检测

CoIP免疫共沉淀技术原理及应用：

免过疫共沉淀技术是一种研究两种蛋白在体内是否存在相互作用的有效方法，通过抗体和已知蛋白结合，从而捕获整个已知蛋白复合物，进而研究复合物中与已知蛋白存在相互作用的蛋白。

原理:CO-IP在IP基础上，通过特定抗体沉淀出与目标蛋白相互作用的蛋白质，揭示蛋白质间的相互关系。

作用:检测2个蛋白是否在体内。

应用:可用于构建蛋白质相互作用的网络，发现目标蛋白的结合伙伴。适用于鉴定特定蛋白质的相互作用伙伴，有助于了解蛋白质功能和信号传导。 江苏互作蛋白检测CoIP-MS检测