莆田实时RT-PCR检测技术原理及步骤

时间:2023年07月06日 来源:

Real-time PCR链式反应:每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不但操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。多重连接依赖探针扩增允许用单个引物对扩增多个靶标,从而避免多重PCR的分辨率限制。引物的设计注意事项:1,注意引物设计好后的产物长度。Real-time PCR的较佳产物长度在150-250kb左右(书上说这样可以增加荧光的敏感度,减少实验误差,但是我对这个说法持怀疑态度。产物长度越大,SYBR嵌入的越多,这样才能够保证之后的荧光值比较可信)。2,不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大,就不能使用delt,deltCt法来比较基因表达量的高低。聚合酶链式反应又称多聚酶链式反应。莆田实时RT-PCR检测技术原理及步骤

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内标在传统定量中的作用,由于传统定量方法都是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,而PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验,所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。内标对定量PCR的影响,若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为明显。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。南京细胞数字PCR网站实时定量PCR通用电脑,自动分析软件等构成。

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Real-time PCR原理:所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。DNA结合染料法,应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。检测所有双链DNA扩增产物,包括非特异反应产物,如引物二聚体。可对任何双链DNA进行定量;不需要探针,因此减少了实验设计及运转成本;适合于大量基因的分析;简单易用。实时荧光定量PCR:实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-time PCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

聚合酶链式反应:因为PCR扩增了目的DNA区域,所以PCR可以用于分析极少量的样品。这对于法医检定法,当时只有微量的DNA可作为证据。聚合酶链反应也可用于分析古代DNA那已经有数万年的历史了。这些基于聚合酶链反应的技术已经成功地应用于动物身上,例如四万年前猛犸,以及人类DNA,定量聚合酶链反应或者实时聚合酶链反应不要与逆转录-聚合酶链反应方法混淆)允许估计样品中存在的给定序列的量——这种技术通常用于定量确定基因表达的水平。定量PCR是一种已建立的DNA定量工具,用于测量每轮PCR扩增后DNA产物的积累。聚合酶链反应的试剂应分配到一次性的等分试样中。Real-time PCR探针法普遍用于人类传染病的诊断和病原定量。

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Real-time PCR:所谓Real-time PCR技术,是指在PCR反应体系中加入萤光基团,利用萤光信号累积实时监测整个PCR进程,之后通过标準曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用萤光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标準曲线的分析对起始模板进行定量分析。Real-time PCR技术即实时萤光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差,提高实验的重複性。该技术已经被普遍用于监测细胞mRNA表达量的变化;比较不同组织的mRNA表达差异;验证基因晶片,siRNA干扰的实验结果。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限。南京细胞数字PCR网站

Real-time PCR利用萤光信号累积实时监测整个PCR进程。莆田实时RT-PCR检测技术原理及步骤

Real-time PCR操作流程:1、收集样品。2相关试剂总RNA提取试剂TREzolReagent(RNA提取试剂),M-MLV(cDNA逆转录酶),RNA纯化试剂,RealqPCRMasterMix(萤光定量PCR预混试剂)。3实验仪器萤光定量PCR仪;PCR仪;低温离心机。4总RNA提取。5cDNA合成在0.5ml的离心管中加入1µl模板总RNA(1µg/µl);Real-time PCR操作流程:2µl随机引物(T18,10pmol/ul);2µl10mMdNTPmix;加水至15µl体系。混匀后70℃变性RNA5分钟,冰上速冷1分钟,离心将溶液收集至管底加入6µl5×PCRbuffer;1µlRNaseout;1µlM-MLVRT;加水至30µl体系。PCR仪中反应条件设定37℃延伸60min,70℃保温15min终止反应。合成好的cDNA置于-20℃保存备用。莆田实时RT-PCR检测技术原理及步骤

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