天津胰酶常见问题

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37°℃时，胰酶溶液的作用能力**强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如:D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。胰酶细胞消化液(不含EDTA)消化细胞时间不宜过长,否则细胞铺板后生长状况会较差。天津胰酶常见问题

    冰冻保存，但不得反复冻融。供试品溶液的制备取本品适量，精密称定，加。测定法取底物溶液、（pH）1ml，混匀，作为空白。取供试品溶液（预热至25℃±℃），立即计时并摇匀，使比色池内的温度保持在25℃±℃，照紫外－可见分光光度法（2010年版*典二部附录ⅣA），在237nm的波长处，每隔30秒读取吸光度，共5分钟，每30秒钟吸光度的变化率应恒定，且恒定时间不得少于3分钟。以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，作图，取在3分钟内成直线部分的吸光度，按下式计算。式中P为每2500胰蛋白酶单位中含糜蛋白酶的量，单位；A2为直线上开始的吸光度；A1为直线上终止的吸光度；T为A2至A1读数的时间，分；W为测定液中含供试品的量，mg;，吸光度每分钟改变，即相当于1个糜蛋白酶单位。每2500单位胰蛋白酶中不得多于50单位的糜蛋白酶。干燥失重取本品适量，以五氧化二磷为干燥剂，在60℃减压干燥4小时，减失重量不得过（2010年版*典二部附录ⅧL）。胰蛋白酶效价测定底物溶液的制备取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐，加水溶解使成100ml，作为底物原液；取10ml，用磷酸盐缓冲液（取，pH值为）稀释成100ml，照紫外－可见分光光度法（2010年版*典二部附录ⅣA），恒温于℃±℃，以水作空白。天津胰酶常见问题胰蛋白酶溶液用于组织和单层细胞的解离。

胰酶操作步骤：

(*供参考) ：1. 吸取培养基，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以除去残余的血清。2. 加入适量的胰蛋白酶消化液，略盖过细胞即可。根据细胞的特性可以增加或减少胰酶用量，室温放置30秒至2分钟。（不同的细胞消化时间有所不同）3. 显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用***吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。4. 此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。

    ①制备粗酶液称取定量粗胰酶，其胰蛋白酶活性为，胰淀粉酶活性为，胰脂肪酶活性为。将其用pH值为、浓度为0．2mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，然后进行真空过滤，收集滤液并用磷酸缓冲液进行稀释，使胰蛋白酶活性为3-10U/mg，备用。②制备反胶束将AOT置于100℃烘箱中干燥至恒重，放入干燥器中冷却至室温。然后称取，加入10L异辛烷，在搅拌下使其形成均匀的分散液，再加入定量蒸馏水，在200r/min的转速下处理2h，获得浓度为。使用时用异辛烷稀释10倍。③萃取将稀释10倍的AOT-异辛烷反胶束置于萃取器中，按照AOT异辛烷反胶束：粗酶溶液体积比为（2-3):1的比例加入粗酶溶液萃取3-4次，，在300-400r/min的转速下萃取5-10min。如此每次萃取完成后，均进行离心分离，离心机转速为4000-6000r/min，时间10-15min收集、合并离心上层清液，进行反萃取，下层萃余液用于制备胰脂肪酶。④反萃取将荷载胰蛋白酶的AOT-异辛烷反胶束置于萃取器中，在搅拌下加入等体积的反萃取液进行反萃取15-20min萃取液为0．。如此反萃取3次，每次萃取完成后，均进行离心分离，离心机转速为4000-6000r/min,时间为15-20min。分别收集、合并离心上层清液和下层反萃取液，前者再生后可再次萃取胰蛋白酶。 胰酶PH的变化是肉眼可观察到的。

    胰蛋白酶：（Trypsin）为蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。由223个氨基酸残基组成的单链多肽，主要切割赖氨酸和精氨酸羧基端。按干燥品计算，每1mg中胰蛋白酶的活力不得少于2500单位。作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力**强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。终止消化时，可用含有血清培养液终止胰酶对细胞的作用。有些细胞容易消化（如鸡胚原代成纤维细胞）可用胰酶进行消化，可以不加EDTA。 胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。宁夏进口胰酶供应商家

EDTA是一种化学螯合剂，主要作用在于能螯合Ca、Mg离子，使细胞分离。天津胰酶常见问题

0.25%胰酶是细胞生物学中常用的一种生物试剂，下面汇总一下胰酶使用过程中常见的一些问题。胰酶的使用浓度是多少？胰酶浓度：常用0.25%胰酶+0.02%EDTA作为消化液。为什么收到的胰酶会有颜色差异？商品化胰酶溶液需要用干冰运输，在运输过程中，胰酶溶液中的二氧化碳与干冰挥发的二氧化碳可能会极少部分的气体交换，导致溶液PH的漂移。有些胰酶溶液里含有酚红作为PH值指示剂，因此胰酶PH的变化是肉眼可观察到的。由干冰运输过程中导致的PH值的变化很小，PH值会从7.2-8.0变化到了6.8左右，在PH值7.2-8.0的时候，溶液呈淡红色；PH值6.8左右时呈淡黄色。因此胰酶颜色的变化是由PH值的变化引起，归因于使用干冰运输。这种颜色的变化是行业普遍现象，在不同供应商的胰酶产品都会出现。天津胰酶常见问题