苏州Protein AG免疫沉淀磁珠现货
时间：2024年06月29日
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免疫沉淀实验不同于WB实验的样品制备，对实验样品制备要求更高，除了要控制所有操作尽量在冰上完成外，关键的是裂解液的成分，裂解液成分直接决定了样品质量。
主要影响：
1. 蛋白的释放：许多目的蛋白定位在细胞器，质膜，细胞核，细胞骨架中，但通常这些亚细胞结构很难被裂解液有效溶解，所以很难将这些蛋白释放出来。
2. 蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质间相互作用影响程度不同，一些互作较弱的蛋白对尽管在比较温和的裂解液配方中仍然会被破坏。
免疫沉淀纯化所得抗原纯度低是什么原因？苏州Protein AG免疫沉淀磁珠现货
Co-IP（免疫共沉淀）技术主要用于研究蛋白质之间的相互作用，其实验设计如下：
1. 样品准备：Co-IP实验通常有两种，一种是内源性蛋白相互作用验证，一种是非内源性蛋白相互作用验证。内源性相互作用通过质粒共转染的方式将两种蛋白转染至同一细胞内表达；非内源性相互作用则是将含有靶蛋白的组织进行预处理及细胞裂解获得细胞裂解液。
2. 沉淀诱饵蛋白：利用磁珠偶联抗体沉淀诱饵蛋白。在样品中加入磁珠偶联抗体，抗体会与诱饵蛋白结合，利用磁铁将磁珠拉下，同时诱饵蛋白会一起被沉淀出来。
3. SDS-PAGE及WB检测：得到沉淀后，需要验证沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE将蛋白复合物分离，随后利用WB检测是否存在靶蛋白。
4. 实验对照设置：为了避免“假阳性”，需要设置正确的对照，包括阴性对照和阳性对照（Input组）。Input组为直接利用抗体对细胞裂解液进行WB检测，验证细胞裂解液中存在蛋白。
5. 结果真实性：确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。使用单克隆抗体有助于避免污染的发生。
广州Protein AG免疫沉淀磁珠应用免疫沉淀技术的应用。
ChIP实验的基本步骤包括：
1. 交联（Crosslinking）：细胞被甲醛等交联剂处理，使得蛋白质和DNA之间的相互作用被固定，形成稳定的蛋白质-DNA复合物。
2. 细胞裂解：裂解细胞，释放染色质，同时保持蛋白质-DNA复合物的完整性。
3. 超声或酶解：通过超声或酶解将染色质切割成较小的片段，以便于后续步骤中的免疫沉淀。
4. 免疫沉淀（Immunoprecipitation）：加入针对特定组蛋白修饰或转录因子的抗体，这些抗体会特异性地结合到目标蛋白质上。
5. 捕获复合物：使用蛋白A或蛋白G结合的珠子捕获抗体-蛋白质-DNA复合物。
6. 洗涤：洗涤珠子以去除未特异性结合的蛋白质和DNA片段。
7. 逆转录交联：将捕获的复合物从珠子上洗脱，并进行逆转录交联，使固定的蛋白质-DNA复合物分离。
8. DNA纯化：纯化从免疫沉淀中得到的DNA片段。
9. 分析：通过qPCR、芯片分析（ChIP-chip）或高通量测序（ChIP-seq）等方法分析沉淀的DNA片段，以确定特定蛋白质在基因组上的结合位点。
免疫沉淀纯化所得抗原纯度低一般有多种原因：
1. 非特异性蛋白污染
如果洗脱所得抗原纯度较低，则有几种方法可以进行优化。在结合或洗涤缓冲液中加入去污剂或其他可以降低非特异性结合的组分。使用普通微珠预纯化样本还可以降低非目标分子的共纯化。此外，还可以使用无关蛋白 (如BSA) 封闭微珠 。
2. 抗体污染
使用蛋白A、G或A/G的经典免疫沉淀实验中会出现抗体与抗原共洗脱的情况。如果共洗脱会影响下游分析，则需要使用抗体通过共价连接固定至微珠的方法进行实验，如Pierce 直接 IP 或交联 IP 的形式。
免疫沉淀纯化所得抗原量低是什么原因？
免疫沉淀技术（Immunoprecipitation，简称IP）是一种生物化学方法，它利用特异性抗体对抗原进行亲和纯化。在含有目的抗原的细胞裂解液中加入特定的抗体以及Protein A/G-Beads（预先将Protein A/G固定结合在磁珠上），根据抗原与抗体、Protein A/G与抗体的Fc的特异性，形成“抗原-抗体-Protein A/G-Beads”复合物，清洗离心后去除溶液中未结合的杂蛋白，检测是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技术常用于从细胞或组织裂解物中分离用于免疫印迹检测或其他检测技术的蛋白和其他生物分子。它的目标是分离足够用于Western Blot或其他检测方法检测的蛋白质。
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免疫沉淀实验步骤：
1. 样品制备
a. 悬浮细胞样品处理：离心收集细胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液（裂解液应在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂Cocktail，使蛋白酶抑制剂Cocktail的终浓度为1×）。混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。
b. 贴壁细胞样品处理：移去培养基，用PBS清洗细胞两遍；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5mL EP管内，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液（裂解液应在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂Cocktail，使蛋白酶抑制剂Cocktail的终浓度为1×）。吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。
4. 后续：磁珠预处理——抗体吸附——抗原结合反应——抗体洗脱
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