国内荧光双光子显微镜光刺激

双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫兹。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是比较高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦，提高了荧光检测效率。由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，适用于长时间的研究。国内荧光双光子显微镜光刺激

双光子之源：飞秒激光双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。国内2PPLUS双光子显微镜供应商用双光子显微镜看看你的皮肤有没有重焕新生。

双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。

而配合了双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么，什么是双光子激发技术呢？在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级，经过一个很短的时间后，电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子（P=h/λ）。利用这个原理，便诞生了双光子激发技术。双光子显微镜使用长波长脉冲激光，通过物镜汇聚，由于双光子激发需要很高的光子密度，而物镜焦点处的光子密度是比较高的，所以只有在焦点处才能发生双光子激发，产生荧光，该点产生的荧光再穿过物镜，被光探头接收，从而达到逐点扫描的效果。双光子显微镜使用高能量锁模脉冲器。

刚好双光子在这两点具有很大的优势在实际操作中成像的深度和样品的关系很大，双光子成像利用高亮度的荧光标记材料，已经有做到mm级别的穿透深度HighqualitycellularTPimagingwithhighsignal-to-backgroundratio(>100)andtissueimagingwithapenetrationdepthof2200μmhavebeenachievedwithP-QDasprobe.ExtremelyHighBrightnessfromPolymer-EncapsulatedQuantumDotsforTwo-photonCellularandDeep-tissueImaging:ScientificReports:NaturePublishingGroup双光子显微镜在组织透明化成像中应用；美国激光荧光双光子显微镜授权供应商

双光子显微镜可精确穿透较厚标本进行定点、有生命体的观察！国内荧光双光子显微镜光刺激

为了验证动物生物样品的时间分辨成像能力，本实验观察了活海拉细胞高尔基体中的青色荧光蛋白mTFP1，见图3(a),(c)-(i)。使用的物镜及尺寸与荧光颗粒成像一致，对比可见v2PE在空间分辨率、激发深度级图像对比度较常规宽场显微镜都有所提高。此外，v2PE可以同时激发多个波长的荧光蛋白，这种技术还可以应用于细胞内分子的三维动力学多色成像。在此基础上，实验对海拉细胞中的高尔基体(mTFP1)和纤颤蛋白(EGFP)进行了在体成像，见图3(j)-(n)，青色为mTFP1,绿色为EGFP，实验中两种荧光蛋白同时成像，终采用光谱分离法将不同蛋白的荧光信号分离出来。国内荧光双光子显微镜光刺激