美国啮齿类多光子显微镜作用

首代小型化双光子显微镜在国际上获得小鼠自由行为过程中大脑神经元和突触的动态图像后，我们成功研制了第二代小型化双光子显微镜。它具有更大的成像视野和三维成像能力，可以清晰稳定地对自由活动小鼠三维脑区的数千个神经元进行成像，实现对同一批神经元的一个月追踪记录。通过对微光学系统的重新设计系统的。微物镜工作距离延长至1mm，实现无创成像。内嵌可拆卸的快速轴向扫描模块，可采集深度180微米的3D体成像和多平面快速切换的实时成像。该扫描模块由一个快速的电动变焦透镜和一对中继透镜组成，在不同深度成像时可保持放大倍率恒定。其变焦模块重量，研究人员可根据实验需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探头可整体即时拔插，极大地简化了实验操作，避免了长周期实验时对动物的干扰。在重复装卸探头同一批神经元时，视场旋转角小于，边界偏差小于35微米。由于双光子激发的特性，它可以获得比传统显微镜更高的分辨率。美国啮齿类多光子显微镜作用

对两个远距离（相距大于1-2mm）的成像部位，通常使用两条单独的路径进行成像；对于相邻区域，通常使用单个物镜的多光束进行成像。多光束扫描技术必须特别注意激发光束之间的串扰问题，这个问题可以通过事后光源分离方法或时空复用方法来解决。事后光源分离方法指的是用算法来分离光束消除串扰；时空复用方法指的是同时使用多个激发光束，每个光束的脉冲在时间上延迟，这样就可以暂时分离被不同光束激发的单个荧光信号。引入越多路光束就可以对越多的神经元进行成像，但是多路光束会导致荧光衰减时间的重叠增加，从而限制了区分信号源的能力；并且多路复用对电子设备的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率来维持近似单光束的信噪比，这会容易导致组织损伤。美国荧光多光子显微镜原理滔博生物多光子显微镜是一种高级的显微镜技术.

多光子激发在紫外成像的优势在可见光脉冲中能得到紫外衍射的显微观察像。即使不使用紫外域光源、光学元件用可见光源、光学元件就能得到紫外光激励的高空间分辨率图像。多光子在生物成像中的优势在生物显微镜观察方面，较早考虑的是不损坏生物本身的活性状态，维持水分、离子浓度、氧和养分的流通。在光观察场合，无论是热还是光子能量方面都必须停留在细胞不受损伤的照射量、光能量内。多光子显微镜则能够满足此，而且还具有很多优点。如三维分辨率、深度侵入、在散射效率、背景光、信噪比、控制等方面，均有以往激光显微镜不具备，或具有无法比拟的超越特性。

细胞在受到外界刺激时，随着刺激时间的增长，即使刺激继续存在，Ca2+荧光信号不但不会继续增强，反而会减弱，直至恢复到未加刺激物时的水平。对于细胞受精过程中Ca2+荧光信号的变化情况，研究发现，配了在粘着过程中，Ca2+荧光信号未发生任何变化，而配子之间发生融合作用时，Ca2+荧光信号强度却会出现一个不稳定的峰值，并可持续几分钟。这些现象，对研究受精发育的早期信号及Ca2+在卵细胞和受精卵的发育过程中的作用具有重要的意义。在其它一些生理过程如细胞分裂、胞吐作用等，Ca2+荧光信号强度也会发生很强的变化。多光子显微镜之类的先进光学技术能够在活生物体的大脑表面下更深地成像。

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了一种加快2PM轴向扫描速度的方法[2]。在光学显微镜中，物镜或样品的缓慢轴向扫描速度限制了体积成像的速度。近年来，通过使用远程聚焦技术或电可调谐透镜（ETL）已经实现了快速轴向扫描；但是，远程聚焦中反射镜的机械驱动会限制轴向扫描速度，ETL会引入球面像差和更高阶像差，从而无法进行高分辨率成像。为了克服这些局限性，该组引入了一种新颖的光学设计，能将横向扫描转换为可用于高分辨率成像的无球差的轴向扫描。该设计有两种实现方式，第一种能够执行离散的轴向扫描，另一种能够进行连续的轴向扫描。具体装置如图3a所示，由两个垂直臂组成，每个臂中都有一个4F望远镜和一个物镜。远程聚焦臂包含一个检流扫描镜（GSM）和一个空气物镜（OBJ1），另一个臂（称为照明臂）由一个水浸物镜（OBJ2）构成。将这两个臂对齐，以使GSM与两个物镜的后焦平面共轭。准直的激光束被偏振分束器反射到远程聚焦臂中，GSM对其进行扫描，进而使得OBJ1产生的激光焦点进行横向扫描。从双光子到三光子甚至四光子，这种非线性成像技术通常也被统称为多光子显微镜。在体多光子显微镜Ultima Investigator

多光子显微镜在临床前评价IA形态、细胞外基质、细胞密度和血管形成等方面显示出强大的作用。美国啮齿类多光子显微镜作用

在多光子显微镜（也称为非线性或双光子显微镜）中，以两倍正常激发波长照射样品。更长的波长是有利的，因为它们可以更深地穿透样品进行3D成像，并且因为它们不会损坏样品，从而延长样品寿命。为了实现多光子激发，照明光束在空间上聚焦（使用光学器件），同时使用高能短脉冲激发光束以提高两个（或更多）光子同时到达同一位置（即荧光团分子）的概率。多光子显微技术的例子包括二次谐波产生(SHG)、三次谐波产生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)和受激发射耗尽(STED)显微技术。由于这些技术中的每一种都使用脉冲激光器，因此选择能够比较大限度地减少脉冲色散的光学组件很重要，并且激光反射二向色镜应具有低GDD特性。美国啮齿类多光子显微镜作用