collagen1(COL-1)免疫荧光检查

细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1. 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。7. 较好用DAPI染核，然后直接照荧光片。8. 蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。使用荧光抗体方法是免疫荧光技术中常见的操作步骤。collagen1(COL-1)免疫荧光检查

在神经退行性疾病的研究中，以阿尔茨海默病为例，多重免疫组化可以同时标记 β - 淀粉样蛋白（Aβ）、tau 蛋白和神经元特异性标志物，如神经元核抗原（NeuN）。Aβ 的沉积和 tau 蛋白的过度磷酸化是阿尔茨海默病的两大病理特征。通过多重免疫组化，我们可以在大脑组织切片上清晰地看到 Aβ 斑块和 tau 蛋白缠结与神经元的位置关系，了解它们是如何影响神经元的结构和功能的。同时，对比正常脑组织和患病脑组织中这些标志物的分布和数量差异，有助于深入探究阿尔茨海默病的发病机制。PDL-1/CD274免疫荧光染色荧光抗体技术可用于检测和定位各种抗原，也可以用于检测和定位抗体。

在病毒***的研究中，这两种技术有助于深入了解病毒与宿主细胞的相互作用。例如，在研究流感病毒***时，我们可以用一种颜色的荧光标记流感病毒的**白（NP），以确定病毒在宿主细胞内的定位；用另一种颜色标记宿主细胞的受体分子，如唾液酸受体，观察病毒是如何识别并结合受体进入细胞的；再用第三种颜色标记宿主细胞内与抗病毒免疫相关的蛋白，如干扰素诱导蛋白。这样，通过多色免疫荧光，我们可以在一个视野下***地看到病毒入侵的整个过程，包括病毒进入细胞的位点、在细胞内的复制位置以及宿主细胞的免疫反应启动情况。在细菌***方面，多重免疫荧光也发挥着重要作用。以结核杆菌***为例，我们可以用不同颜色的荧光分别标记结核杆菌本身、被***的巨噬细胞内的溶酶体以及与炎症反应相关的细胞因子。通过这种方式，能够观察到结核杆菌在巨噬细胞内的存活状态，是被溶酶体包裹还是逃逸了溶酶体的杀伤，同时也能看到***过程中巨噬细胞周围炎症反应的强度和范围，这对于深入研究结核杆菌的致病机制以及开发新的***策略具有重要价值。

免疫荧光间接法测抗体实验注意事项：1）荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。2）每次试验时，需设置以下三种对照：①阳性对照：阳性血清+荧光标记物②阴性对照：阴性血清+荧光标记物③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物3.已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。4.所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。在1941年，Coons初次成功地使用荧光素作为标记物质进行免疫荧光实验。

荧光物质，荧光色素：许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：⑴异硫氰酸荧光素为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，较大吸收光波长为490--495nm，较大发射光波长520--530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用较普遍的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。⑵四乙基罗丹明为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性质稳定，可长期保存。结构式如下：较大吸收光波长为570nm，较大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。⑶四甲基异硫氰酸罗丹明结构式如下：较大吸引光波长为550nm，较大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。免疫荧光技术可以用于研究肉瘤的发生和发展过程。VEGFR2免疫荧光检查

荧光抗体标记使得抗原定位变得可视化，有助于观察细胞结构和功能。collagen1(COL-1)免疫荧光检查

荧光素标记抗体的方法：方法及步骤：①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使然后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。collagen1(COL-1)免疫荧光检查