湖南胰酶常用知识

    ①制备粗酶液称取定量粗胰酶，其胰蛋白酶活性为，胰淀粉酶活性为，胰脂肪酶活性为。将其用pH值为、浓度为0．2mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，然后进行真空过滤，收集滤液并用磷酸缓冲液进行稀释，使胰蛋白酶活性为3-10U/mg，备用。②制备反胶束将AOT置于100℃烘箱中干燥至恒重，放入干燥器中冷却至室温。然后称取，加入10L异辛烷，在搅拌下使其形成均匀的分散液，再加入定量蒸馏水，在200r/min的转速下处理2h，获得浓度为。使用时用异辛烷稀释10倍。③萃取将稀释10倍的AOT-异辛烷反胶束置于萃取器中，按照AOT异辛烷反胶束：粗酶溶液体积比为（2-3):1的比例加入粗酶溶液萃取3-4次，，在300-400r/min的转速下萃取5-10min。如此每次萃取完成后，均进行离心分离，离心机转速为4000-6000r/min，时间10-15min收集、合并离心上层清液，进行反萃取，下层萃余液用于制备胰脂肪酶。④反萃取将荷载胰蛋白酶的AOT-异辛烷反胶束置于萃取器中，在搅拌下加入等体积的反萃取液进行反萃取15-20min萃取液为0．。如此反萃取3次，每次萃取完成后，均进行离心分离，离心机转速为4000-6000r/min,时间为15-20min。分别收集、合并离心上层清液和下层反萃取液，前者再生后可再次萃取胰蛋白酶。 使用胰酶细胞消化液(不含EDTA)的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。湖南胰酶常用知识

    胰酶使用注意：1、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。2、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。胰酶配制方法：1、培养液配制，方便好用，对细胞影响小，并且培养液的ph值正好适合胰蛋白酶的溶解2、生理盐水配制，要先调ph值（①胰酶（1：250）②③④⑤⑥⑦Water1000mL磁力搅拌2-3小时，调，过滤除菌。）3、pbs（：称取胰酶粉末，先用少许灭菌过的PBS调成糊状，然后补足到100ml。置室温搅拌4小时或冰箱内过夜，过滤灭菌，分装，4℃保存备用。）;或是hanks或是D-hanks液配制（1.称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks平衡盐溶液（）调成糊状，然后再补足D-Hanks平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；2.次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH至。）一般，至于作用效果，需要消化一次细胞感觉一下，因为不同厂家的酶不一样，有的作用温和，有的作用剧烈。4、是否需要四度放置过夜，取决于你的胰酶的纯度。过去的胰酶纯度不高，所以难以溶解，需要四度过夜.而现在的胰酶纯度都很高。 湖南胰酶常用知识0.25%胰酶消化液（含有EDTA，含酚红）pH值为7.2-7.8。

胰蛋白酶是一种肽链内切酶，属于丝氨酸蛋白酶家族，不仅可以水解碱性氨基酸（精氨酸或赖氨酸）羧基端的肽键，还可以水解由碱性氨基酸的羧基形成的酰胺键或酯键。胰蛋白酶可以从牛、猪等哺乳动物的胰脏提取，经过纯化后获得结晶，再制成冻干制剂。牛的胰蛋白酶有223个氨基酸，分子量为23800道尔顿，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。胰蛋白酶溶于水，不溶于乙醇、甘油和三氯甲烷等有机溶剂。胰蛋白酶的等电点pH值为10.1，**适pH值范围在7.8~8.5左右，pH值大于9.0时不可逆失活。钙离子对胰蛋白酶的酶活具有保护和***作用。[1]

    只断裂赖氨酸或精氨酸胰蛋白酶原的***过程的羧基参胰蛋白酶降解物分析与形成的肽键。白色或米黄色结晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和**。分子量24000，pI，**适pH值～。pH>。Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶**剂对其活性有强烈**。临床用于抗消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。胰蛋白酶*典标准胰蛋白酶来源含量本品系自猪、羊或牛胰中提取的蛋白分解酶。按干燥品计算，每1mg中胰蛋白酶的活力不得少于2500单位。胰蛋白酶制法要求本品应从检*合格的牛、羊或猪胰中提取，生产过程应符合现行版《*品生产质量管理规范》的要求。胰蛋白酶性状本品为白色或类白色结晶性粉末。胰蛋白酶鉴别取本品约2mg，置白色点滴板上，加对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐试液，即显紫色。胰蛋白酶检查酸度取本品，加水溶解并制成每1ml中含2mg的溶液，依法测定（2010年版*典二部附录ⅥH），pH值应为～。溶液的澄清度取本品，加，依法检查（2010年版*典二部附录ⅨB），溶液应澄清。糜蛋白酶-底物溶液的制备取N-乙酰-L-酪氨酸乙酯，置100ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液（取，混合，pH值为）50ml，温热使溶解，冷却后再稀释至刻度，摇匀。胰酶浓度：常用0.25%胰酶+0.02%EDTA作为消化液。

胰酶中的酚红有哪些作用？酚红在培养基中被用来作为pH指示剂，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明：酚红可以模拟固醇类***（特别是雌***）的作用。为避免固醇类反应，培养细胞尤其是哺乳类细胞时，建议用不含酚红的培养基。由于酚红干扰检测，在做流式细胞检测时，也会使用不含酚红的培养基或者胰酶。图 2. Phenol red test图片来源网络8、在做细胞凋亡检测时，细胞为什么不能用含有EDTA的胰酶消化？Annexin V（膜联蛋白）是Ca2+依赖的蛋白，EDTA会螯合Ca2+从而影响Annexin V，进而影响结果，因此需选用不含EDTA的胰酶。建议放入培养箱中进行消化，时间可以长一点。随时观察细胞情况，避免消化过度；也可使用细胞刮刀将细胞刮下，后用***吹匀，比消化简单，还可避免使用胰酶带来的伤害。胰酶可在-20℃下保存一年。湖南胰酶常用知识

胰酶使用的时候要注意什么？湖南胰酶常用知识

    使**或细胞片分散成单个细胞，制成细胞悬液用于进一步的实验。影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。加入胰蛋白酶-EDTA溶液，视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润；一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时，弃去细胞消化液，或看见培养瓶壁呈白茫状即可。并加入适量的完全培养液终止消化，吹打分散；如见大量细胞片状脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作。（消化过头，可造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成细胞破碎。由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂，所以加入完全培养基可以终止反应。胰酶配置方法：1、培养液配制，方便好用，对细胞影响小，并且培养液的ph值正好适合胰蛋白酶的溶解2、生理盐水配制，要先调ph值（①胰酶（1：250）克②EDTA-Na③NaCl④KCl⑤Glucose⑥PhenolRed⑦Water1000mL磁力搅拌2-3小时，调pH，过滤**。）3、pbs（：称取胰酶粉末。湖南胰酶常用知识