天津PNGaseF去糖基化酶糖生物学研究

水解O-聚糖的酶不会从变性中获益，这就是为什么OmniGLYZOR色谱柱只能在天然条件下使用的原因。 OmniGLYZOR 试剂盒 Microspin 以含有足够材料的试剂盒形式提供，可使5 × 50-100 μg 或 10 × 50-100 μg 糖蛋白去糖酸化。N-和O-连接聚糖的快速高效；与LC-MS兼容；完全去除聚糖，改进基础蛋白的分析；固定形式可提高酶与底物的比率，从而实现快速去糖基化。 IgdE酶(FabALACTICA®)和PNGaseF酶分别购自Genovis(马萨诸塞州，美国)。用于水解糖蛋白上N-聚糖的冻干酶。Genovis的PNGase F 冻干剂以冻干粉的形式提供，装在 1000 或 5 x 1000 单位小瓶中，分别用于消化 1 mg 或 5 x 1 mg 糖蛋白。复杂样品的特异性净化；改进 MS 分析的样品制备。天津PNGaseF去糖基化酶糖生物学研究

G0F 抗体在 30 分钟内：半乳糖的存在会影响zhiliao性抗体引发的效应功能，为了研究抗体的作用方式，可能需要彻底去除半乳糖残留物。Genovis的GalactEXO Immobilized 的 β1-4 半乳糖苷酶活性在曲妥珠单抗上使用 30 分钟孵育证明。genovis的GalactEXO Immobilized 由强大的 GalactEXO 酶组成，该酶固定在琼脂糖珠上，并以易于使用的微离心柱形式格式化。GalactEXO是β-半乳糖苷酶的混合物，可有效去除N-和O-糖基化蛋白上的半乳糖残基。使用FabRICATOR®将抗体消化成亚基，并使用LC-MS进行分析。使用 GalactEXO 冻干和 GalactEXO 固定化都可以看到向 G0F 糖型的转变，但后者在z终制剂中没有留下酶。没有任何半乳糖基化结构表明半乳糖残基完全水解，因此LC-MS数据中任何剩余的次要峰都可以注释为亚基的糖化。没有任何半乳糖基化结构表明半乳糖残基完全水解，因此LC-MS数据中任何剩余的次要峰都可以注释为亚基的糖化。河北瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶糖生物学研究曲妥珠单抗中半乳糖损失的LC-MS数据，进行了释放的N-聚糖分析。

α连接的Genovis的GalNAcs的水解：GalNAcEXO 是一种 α-N-乙酰半乳糖胺苷酶，可有效水解糖蛋白上的末端 GalNAc 残基。与丝氨酸或苏氨酸连接的 GalNAc（称为 Tn 抗原）被 GalNAcEXO 快速有效地水解，并且该酶还在 α1-3 连接的末端 GalNAcs 上显示出活性。Genovis的GalNAcEXO 是一种外α-N-乙酰半乳糖胺酶，用于有效水解与糖蛋白（Tn 抗原）中的丝氨酸或苏氨酸残基相连的 α-N-乙酰半乳糖胺 （GalNAc）。该酶还在 α1-3 连接的末端 GalNAc 上显示活性。GalNAcEXO 在天然条件下水解糖蛋白上的 GalNAc，在 pH 值 6.0 至 7.6 范围内具有高度活性。

SialEXO 2-3 在天然条件下水解糖蛋白，在 pH 值范围为 7.0 至 9.0 时显示出活性。该酶来源于Akkermansia muciniphila，并在大肠杆菌中表达。该酶具有 His 标签，分子量为 66 kDa。1. 用于方法开发的灵活格式；2. 可以结合酶以提高用于离心柱中糖蛋白去唾液酸化的固定化酶。Genovis的SialEXO固定化离心柱含有与琼脂糖珠共价偶联的SialEXO酶，用于糖蛋白的去唾液酸化，而不会被酶污染z终制剂。它水解天然糖蛋白上的唾液酸（α2-3、α2-6 和 α2-8）并释放出聚糖。效率；3. 适用于自动化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可。OglyZOR 来源于口腔链球菌，在大肠杆菌中表达。该酶含有 His 标签，分子量为 227 kDa。

使用Genovis的OpeRATOR图谱O-聚糖位点对依那西普进行LC-MS分析：依那西普是一种 Fc 融合蛋白，具有高度 O-糖基化的铰链区域。将依那西普与OpeRAT一起孵育，并使用LC-MS/MS分析所得糖肽。促红xibao生成素 （EPO） 是一种具有单个 O-糖基化位点的 ~30 kDa 糖蛋白。在PNGase F去除N-糖并使用SialEXO进行去唾液酸化后，用OpeRAT消化天然蛋白，并通过反相LC-MS分析所得蛋白质片段。O-糖基化的位点可以通过识别OeRATOR消化位点直接推断出来。为了获得良好性能，需要去除唾液酸助剂，因此购买中包括2000个单位（如果SialEXO冻干）。1. 用于方法开发的灵活产品形式；2. 可以结合酶以提高效率；3. 适用于自动化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可。O-聚糖是OpeRATOR活性所必需的，而该酶在N-聚糖上没有活性。OpeRATOR和SialEXO处理后，O-糖基化蛋白被消化成携带O-聚糖的肽。消化发生在O-糖基化位点的N端。FucoseEXO固定在离心柱中，可快速方便地处理高达0.5mg的糖蛋白，然后在离心步骤中轻松收集消化的糖蛋白。湖南固定化小柱形式PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

Genovis测试了 SialEXO 冻干和 SialEXO 固定化在人 C1 抑制剂上的性能。天津PNGaseF去糖基化酶糖生物学研究

Fc N-聚糖在抗体的效应功能中起着至关重要的作用，但可能会增加蛋白质表征测定的复杂性。在天然条件下用PNGase F去除Fc N-糖可以表征游离N-糖以及去糖基化抗体的功能和结构。 为了证明PNGase F固定化和PNGase F冻干在天然反应条件下有效去除Fc N-聚糖，对zhiliao性抗体曲妥珠单抗进行了处理。图2中的质量数偏移表明，在37°C下用Genovis的PNGase F冻干或PNGase F固定化孵育1小时后，曲妥珠单抗上的Fc N-聚糖成功去除，与在溶液中用PNGase F冻干处理的样品相比，没有酶干扰用PNGase F固定处理的样品的分析。天津PNGaseF去糖基化酶糖生物学研究